蛋白质凝胶电泳凝胶的制备方法

【材料与试剂】
(1) 30%丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺、1g N,N-亚甲基双丙烯酰胺和60ml温去离子水，加热至37℃溶解，加水至终体积100ml，过滤，然后制备30%（w /v) 丙烯酰胺储存溶液。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在储存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸。这种脱氨基反应是光催化或碱催化的。因此，溶液的pH值不应超过7.0，并应在4°C下储存在棕色瓶中。
(2) 10%十二烷基硫钠(SDS)：称取10g SDS，加入去离子水90ml，加热至68℃，加几滴浓盐酸调至pH7.2，加水至100ml，即 10% (W/v) SDS。
(3)浓缩凝胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl pH 6.8)：12.12g Tris溶于80ml去离子水中，用浓盐酸调至pH 6.8，再加入去离子水至100ml。储存在 4°C。
(4)分离凝胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8)：将18.16g Tris溶于80ml去离子水中，用浓盐酸调pH至8.8，再加入去离子水至100ml。储存在 4°C。
(5) 10%过硫酸胺(AP)：过硫酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。少量 10% (W/V) 可用去离子水配制 保存溶液并在 4°C 下保存。由于过硫酸胺分解缓慢，应每隔一周新鲜配制一次。
(6) TEMED (N, N, N, N-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸胺形成自由基来加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。因为TEMED只能以游离的碱形式起作用，所以pH值低时聚合反应受到抑制。
(7) Tris-甘氨酸电泳缓冲液：分别称取15.1g Tris和94g甘氨酸，溶于900ml去离子水中，再加入50ml 10%(w/v)SDS，再加入去离子水至1000ml变为5?存储解决方案。使用时稀释5倍，Tris终浓度为25mmol/L，甘氨酸为250mmol/L，0.1% SDS，缓冲液pH为（8.3）。
(8)聚丙烯酰胺凝胶电泳槽及电泳仪
(9) 取样器及吸头等。
【操作方法】
(1) 按照立式电泳槽说明书安装玻璃板，并确保配制分离凝胶的浓度和体积，按照《Tris-制备溶液》中所列组分配制所需的分离胶。甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶"（见书末附录）；
(2)将分离胶快速注入两块玻璃板之间的缝隙中，留出浇注胶合胶的空间（梳齿长度加1cm，用滴管小心地将分离胶盖上一层0.1% SDS（丙烯酰胺浓度小于8%时）或异丁醇或水（丙烯酰胺浓度≥10%时），覆盖层可以防止氧气扩散到凝胶中，抑制聚合反应。室温下垂直凝胶；
(3)分离胶*聚合后，倒出覆盖层液体，用去离子水多次冲洗凝胶顶部以去除未聚合的丙烯酰胺，尽可能去除凝胶上的液体；
(4)确定要制备的浓缩胶体积，按“制备Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液"配制所需的浓缩胶，然后将浓缩胶直接倒在分离胶上，立即插入清洁配套梳子以避免气泡，然后加入浓缩凝胶溶液以填充梳子之间的空间。浓缩凝胶聚合后，拔出梳子，形成样品孔；
(5)将Tris-甘氨酸电泳缓冲液用去离子水稀释5倍，倒入电泳槽中，填满样品孔，此时样品孔中的气泡可通过电泳缓冲液消除。